Kääride ja tangidega DNA kallal 1

Magusamast magusam ja krõbedamast krõbedam

Ants Kurg

Selle artikliseeriaga otsime vastust küsimusele: mida uut on molekulaarbioloogia ja biotehnoloogia toonud sellistele traditsioonilistele aladele nagu taime- ja loomakasvatus?

Areng on viimasel paaril aastakümnel olnud tormiline. Selle tulemusel on molekulaarbioloogias ja biotehnoloogias loodud mitmeid uusi meetodeid, mida järjest enam rakendatakse väljaspool laboreid nii toidulaua katmisel, terve elukeskkonna eest hoolitsemisel kui ka paljudes muudes valdkondades. Pelgalt laboriteadusest on saamas meie igapäevase elu lahutamatu osa. Kuigi biotehnoloogiat ei kasutata põllumajanduses ja toiduainete tootmisel nii palju ja nii silmatorkavalt kui näiteks meditsiinis, võib siiski tuua hulgaliselt näiteid eri rakendustest. Võib liialdamata öelda, et põllumajanduses leiab aset "vaikne revolutsioon", sest suurem osa biotehnoloogilisi rakendusi ei loo uusi saadusi, vaid parandab ja täiustab juba olemasolevaid. Näiteks annab viirusvaba kartul palju suuremat saaki, kuid näeb välja täpselt samasugune kui tavaline.

Insenergeneetiliste meetodite kasutamine annab mitmeid eeliseid võrreldes klassikalistega. Kõigepealt selektiivsus. Klassikalisel ristamisel tuleb selleks, et kujundada taimel mingi omadus ja kõrvaldada ebasoovitavad omadused, teha palju ristamisi ja tagasiristamisi. Seevastu insenergeneetika abil saame soovitavat geneetilist informatsiooni sisaldava geeni üle kanda, muutmata taime teisi geneetilisi omadusi. Samuti on oluline, et klassikaline ristamine piirdub vaid omavahel ristuvate taimedega. Hea näide on peiulill (Tagetes), millel on võime eemale tõrjuda mullas elavaid kahjurputukaid. Seetõttu külvavadki aednikud teda aedviljapeenarde lähedusse. Kuid kahjuks ei saa klassikaliste meetoditega seda omadust toidutaimedele üle kanda: nad lihtsalt ei ristu. Insenergeneetika abil on aga võimalik peiulilles leiduv loodusliku insektitsiidi geen üle kanda toidutaimedesse, seega pole vaja kasutada nii palju putukamürke. Lisaks sellele saab insenergeneetiliselt sisestada taimedesse ka muudelt organismidelt pärit geene, mis kodeerivad vajalikke omadusi, näiteks bakteriaalseid insektitsiidide geene. Ja arvatavasti pole kaugel ka aeg, mil insenergeneetika võimaldab taimedes toota inimese valkusid (näiteks antikehi).

Kuidas saab geene üle kanda ühelt organismilt teisele? Milliseid "tööriistu" molekulaarbioloogid selleks kasutavad?

Kõigepealt on vaja täpselt mõista, kuidas toimub geneetilise informatsiooni säilitamine, paljundamine ja edasiandmine järglastele. Molekulaarbioloogia ja insenergeneetika "kolm vaala" on kolm tähtsat avastust.

  • Esiteks. Juba 1944. aastal tõestasid Oswald Avery, Colin MacLeod ja Maclyn McCarthy desoksüribonukleiinhappe (DNA) osa päriliku informatsiooni kandjana. 1953. aastal kirjeldasid James Watson ja Francis Crick DNA struktuuri. Avastati, et DNA kujutab endast kaksikspiraali, koosnedes kahest omavahel seotud DNA ahelast. Kõigi elusorganismide DNA on sarnase struktuuri, funktsiooni ja koostisega. Geen omakorda on DNA lõik, mis kannab informatsiooni valgu tootmiseks. Peagi selgitas Francis Crick ka geneetilise koodi olemuse.
  • Teiseks. Mõningatel bakteritel avastati genoomist eraldi esinevad rõngakujulised DNA molekulid, mida nimetatakse plasmiidideks. Looduses toimub bakterite vahel sageli plasmiidide vahetus, mille käigus geneetiline informatsioon kandub ühelt bakterilt teisele. Plasmiide vastavalt vajadusele modifitseerides on inimesed õppinud neid kasutama "tööriistana", viimaks uut geneetilist informatsiooni nii bakteritesse kui ka bakterist taime.
  • Kolmandaks. Leiti spetsiaalsed DNA-d lõikavad ensüümid (restriktaasid). Restriktaasid on bakteriaalsed ensüümid, mis kaitsevad baktereid võõra DNA (bakteriviiruste e. bakteriofaagide) eest, purustades sissetungija veel enne, kui see jõuab mingit kahju teha. Restriktaasid lõikavad DNA-d väga spetsiifiliselt vastavalt selle struktuurile. Seetõttu on võimalik üksikuid geene eraldada miljoneid geene sisaldavast komplekssest genoomist. Kui plasmiidis on samasugune spetsiifiline järjestus, saab selle ensüümiga avada ka plasmiidi ja liita eelnevalt genoomsest DNA-st eraldatud geeni plasmiidi koosseisu. Uue DNA tüki liitmiseks plasmiidiga kasutatakse teist ensüümi - ligaasi. Võõrast DNA-d (transgeeni) sisaldavat plasmiidi nimetatakse rekombinantseks plasmiidiks. Tavaliselt on plasmiidis terve piirkond spetsiifilisi järjestusi eri restriktaasidele. See võimaldab sinna lülitada eri ensüümidega saadud DNA fragmente. Plasmiidile on lisatud veel spetsiifilised regulaatorjärjestused, mis tagavad sisestatud

Kui katseklaasis segada rekombinantsed plasmiidid bakteritega, sisenevad nad bakteritesse, viies enesega kaasa nendega liidetud uue(d) geeni(d). Bakterirakus toimub vastavalt plasmiidis sisalduvale uuele geneetilisele informatsioonile kas valgu süntees või mõni teine protsess, mida juhib transgeen. Bakterite paljunemisel antakse kogu geneetiline informatsioon edasi tütarrakkudele. Soodsas keskkonnas kasvavad bakterid väga kiiresti. Seetõttu saab meid huvitavat geeni kiiresti paljundada ja kasutada näiteks edasiseks siirdamiseks.

TAIME BIOTEHNOLOOGIA ALAL TOIMUB UURIMISTÖÖ PÕHILISELT KOLMES SUUNAS:

  • toidu kvaliteet;
  • viiruste- ja putukatevastane resistentsus;
  • herbitsiidide tolerantsus.

Need uurimissuunad moodustavad peaaegu 80% kogu uuringute mahust. Ülejäänud 20% käsitlevad järgmisi teemasid: puuvill, metsandus, iluaiandus, taimede stressitaluvus, taimede kasutamine bioreaktorina ja teised uuringud mittetoidutaimedega.

Parem toit biotehnoloogia abiga

Ilmselt igaüht meist huvitab see, mida me sööme. Milline on meie toidu kvaliteet, kas seda on kuidagi keemiliselt töödeldud, kas see sisaldab lisaaineid või säilitusaineid - need on küsimused, millele viimasel ajal pööratakse järjest rohkem tähelepanu. Biotehnoloogia pakub mitmeid huvitavaid lahendusi. Biotehnoloogiliste meetoditega saab parandada toidu kvaliteeti, näiteks pikendada viljade säilivusaega. Selleks on mitu tehnoloogiat.

Kõigepealt etüleeniga seotud tööd. Etüleen (C2H4) on keemiliselt kõige lihtsam taime kasvuregulaator. Etüleen kontrollib kõrgematel taimedel paljusid füsioloogilisi ja arenguprotsesse, nagu viljade küpsemine, varisemine ja mitmesugused vastusreaktsioonid vigastustele. Kui taim on jõudnud vastavasse arengujärku, hakkab ta tootma etüleeni. Seda on võimalik biotehnoloogiliselt pidurdada, blokeerides ensüümi ACC-oksüdaasi tekke. Et viljad ei valmi nüüd täielikult, saab neid koristada ja säilitada tunduvalt pikema aja jooksul. Selleks kasutatakse erilist hoiuruumi, mille õhus on suurendatud süsihappegaasi osa, mis pärsib endogeense etüleeni toime. Niisugused viljad taluvad palju paremini transporti. Jõudnud sihtkohta, võetakse viljad ja "küpsetatakse" nad valmis nn. küpsetuskambris, lisades etüleeni. Kui kaupluses on see kogus läbi müüdud, võetakse hoiukambrist järgmised. Säärast mehhanismi on kasutatud pikendatud säilivusega tomati ja "Euromeloni" loomisel. Üks kasulik näpunäide: kui poest ostetud banaanid on liialt rohelised, sulgege nad tihedalt kilekotti ja pange sooja kohta. Viljades moodustuv endogeenne etüleen teeb oma töö ja varsti maitsevad need banaanid ülihästi. Kui teil on õunakelder, siis korjake plekilised õunad teiste seast kiiresti välja, muidu muutuvad ka naaberõunad plekiliseks. Jälle on etüleen mängus. Blokeerides endogeense etüleeni tekke, on parandatud ka lõikelillede transporditaluvust ja pikendatud säilivusaega.

Teiseks vaatleme polügalaktouronaasi. Polügalaktouronaas (PG) on ensüüm, mis etendab tähtsat osa viljade pehmenemisel: kui vili valmib, lahustab PG osaliselt rakukesta pektiinse osa. Seda mehhanismi kasutatakse edukalt tomatite puhul. Teadlased on eraldanud tomati PG-geeni. Kui selle alusel valmistatud geenikonstruktsioon, nn. antisensgeen, viia taimedesse, blokeeritakse PG süntees. Nii saab vähendada PG ensümaatilist aktiivsust küpsemise ajal kuni 90%. Sellised transgeensed tomatid on ka füsioloogiliselt küpsetena täiesti kõvad ning taluvad hästi transporti ja säilitamist kaupluses. Pole enam vaja koristada pooltooreid tomateid ja neid keemiliselt töödelda, et nad kauem säiliksid. USA biotehnoloogia hiiglane Calgene on niimoodi loonud tomati "Flavr-SavrÔ", mis on üks esimesi ametlikult turule lubatud transgeenseid toiduaineid.

Peale toidu säilivusaja pikendamise tegeldakse ka mitmete muude valdkondadega, näiteks puu- ja juurviljade tahke osise suurendamine (ket'supitomat) ja õlitaimede uuringud eri rasvhapete omavahelise vahekorra muutmiseks. Vaatleme üht näidet: kuidas muuta taimsete saaduste maitseomadusi monelliini geeni lisamisel. Monelliin on magusamaitseline valk, mis looduslikult esineb ühes Aafrika taimes - Dio- scorephyllum cumminsii Diels. Monelliin on ligikaudu 100 000 korda magusam kui suhkur, seetõttu on ta väga perspektiivne suhkruasendaja. Tema eeliseks on asjaolu, et valguna ei ole tal suhkrule ja teistele süsivesikutele omast metaboolset efekti. Monelliini molekul koosneb kahest polüpeptiid- ahelast, mis on omavahel nõrgalt seotud. Kahjuks laguneb monelliini dimeerne molekul kergesti keetmisel või happelises keskkonnas (sidrunhapet sisaldavates karastusjookides) ja kaotab oma magususe. Mida siis teha? Selle ülesande lahendamiseks kasutasid biotehnoloogid teistsugust teed. Nimelt sünteesiti keemiliselt geen, mis kodeerib monelliini mõlemat polüpeptiid- ahelat ühe peptiidina. Niisugust kompleksgeeni nimetatakse liitgeeniks. Nüüd sisestati liitgeen plasmiidi, lisades spetsiifilised regulaatorjärjestused, mida on vaja selle geeni tööks taimes õiges kohas ja õigel ajahetkel (tomatil näiteks valmivates viljades). Rekombinantne plasmiid viidi tomati ja salatitaimedesse ja saadigi magusad tomatid ja magus salat. Nii on võimalik ka teisi taimi magusamaks muuta ilma suhkru ja keemiata.

Kirjeldatud uuringud on küll pealtnäha lihtsad, kuid vajavad siiski väga suuri investeeringuid, jäädes seetõttu eelkõige suurte ja rikaste firmade pärusmaaks. Kuid on ka võimalus, et firmad, keda huvitavad mingid toiduained, paigutavad oma raha ise biotehnoloogiasse. Tuntud näide on McDonalds ja spetsiaalne kartulisort friikartulite ja kartulikrõpsude tootmiseks. Selles transgeenses kartulis on suurendatud tärklise sisaldust 30-60%. Et seal on vähem vett, siis tuleb friteerimisel vähem niiskust välja aurutada, mistõttu kartul ei ima enesesse niipalju õli ja ka energiakulu on väiksem. Tulemuseks on tervislikum friikartul (kui friikartulit üldse saab tervislikuks toiduks nimetada).

Esimesed eksperimendid rekombinantsete DNA-dega tegid seitsmekümnendate aastate alguses Paul Berg, Herbert Boyer ja Stanley Cohen, pannes aluse nn. geenitehnoloogiale. TAIME INSENERGENEETIKA alguseks võib pidada aastat 1983, kui Jeff Schell ja Marc van Montagu esmakordselt sisestasid taime võõrgeeni, kasutades selleks looduslikult esinevat bakterit Agrobacterium tumefaciens. See on mullas elav fütopatogeen, kes looduses nakatab põhiliselt kaheidulehelisi taimi. Infektsiooni tagajärjel kandub osa bakteri Ti-plasmiidist taimeraku kromosoomi. See viis teadlased mõttele kasutada Ti-plasmiidi ülekandemehhanismina uute geenide sisestamisel taimerakku. Et Ti (tumour inducing)-plasmiid põhjustab taimedel haiguslike vohandite teket, tuleb kõigepealt sealt kõrvaldada haigusgeenid. Seejärel lisatakse sobivad regulaatorgeenid ja sisestatakse plasmiidi geen, mida soovitakse taime üle kanda. Nüüd viiakse rekombinantne Ti-plasmiid tagasi Agrobacterium'i ja nakatatakse sellega taime, õigemini taimerakke.

Kuidas kindlustada, et transgeen jõuaks igasse taimerakku? Iga taimerakk on totipotentne. See tähendab, et taime igast d i f e r e n t s e e r u m a t a rakust võib areneda uus terviktaim. Igas taimerakus on geneetiline informatsioon kogu taime jaoks, kuid juba diferentseerunud taimel on mingis taimeosas, näiteks lehes, osa geenidest välja lülitatud. Seega tuleb taime koekultuuris saavutada olukord, kus rakud oleksid diferentseerumata olekus, st. geene saaks vastavalt taime arengule sisse ja välja lülitada. Praktikas käb see järgmiselt: eriliste tangidega lõigatakse taimelehest väikesed kettad. Ketta äärel olevad rakud saavad lõikamise käigus pisut kannatada, muutudes seetõttu A. tumefaciens'ile heaks ründeobjektiks. Nakatamise järel asetatakse taime tükid spetsiaalsele kasvuregulaatoreid ja toitaineid sisaldavale söötmele, mis soodustab diferentseerumata rakkude (kalluse) arengut. Kui kallus on moodustunud, siis vahetatakse sööde ja lisatakse teisi fütohormoone, mis soodustavad juurte ja varte moodustumist. Lõpuks istutatakse taimekesed mulda ja kasvatatakse kasvuhoones täiskasvanud taimeks. Sellelt taimelt saadud seemnetest kasvatatakse teise põlvkonna taimed ning uuritakse, kas nad sisaldavad sisseviidud transgeeni.