Nr. 4/2006


Üksainus küsimus
Valgud on salapärasemad kui geenid

Ei juhtu just iga päev, et Eesti teadlaste uurimistulemused ilmuvad korraga nii mainekates teadusajakirjades kui Nature ja Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. Mis uurimisvaldkonnaga on tegu ja mis probleeme käsitlevad tunnustust pälvinud tööd?

Vastab vastselt Nature’s “käe valgeks teinud” biokeemik

KALLE KILK



Viimasel ajal on palju räägitud geenidest ja geenitehnoloogia arengust. Geenid kannavad informatsiooni ja määravad organismi põhitunnused. Geeniuuringud võimaldavad ennustada pärilikke haigusi, identifitseerida kurjategijaid ja teha muud kasulikku. Peale informatsiooni talletamise on DNA-l ja seetõttu ka geenidel siiski vähe muid otseseid funktsioone. Informatsiooni lugemiseks ja reaalseks rakendamiseks vajab organism teist liiki nukleiinhappeid, RNA-sid, ja valke. RNA-del ja valkudel on palju ülesandeid, kaasa arvatud teiste valkude ja RNA-de ning vajadusel isegi uute DNA ahelate sünteesimine.

Geneetilise info lugemiseks ja “elluviimiseks” peab kõigepealt toimuma nn transkriptsioon ehk geenile vastava RNA süntees. Lisaks sünteesivale ensüümile läheb siin vaja ka “abistajaid”. Abistajad reguleerivad, mitu koopiat antud RNA-d sünteesida, pakendavad tekkinud ahelad ja kontrollivad üleüldse kõiki pisiasju. Need abistajad on enamasti valgulised ained. Osa neist valkudest jääb RNA-ga seotuks ka pärast selle valmimist, teised asendatakse uute valkudega. Ka siis, kui RNA tõlgitakse edasi valguks, on selle ümber unikaalne segu abistajaid.

Keskkonnamuutused, haigused ja kõik muu, mis nõuab organismilt kiiret reageerimist, ei mõjuta mitte geene, vaid nende kasutamist. See tähendab, et RNA-de ja valkude hulk ning omavaheline suhtlemine on väga dünaamiline. Arvatakse, et tervel inimesel on geenide ja nendelt toodetud RNA-de ning regulatoorsete valkude kompleksid teistsugused kui haigel inimesel, isegi kui igasugune geneetiline erinevus puudub.

Vastupidiselt nukleiinhapete vastastikmõjule on valkude koostööd ja interaktsioone nukleiinhapetega raske ennustada. Tüüpilise uurimismeetodina on seni mingit puhast nukleiinhapet või valku loksutatud vastavalt valkude või nukleiinhapete segus ning seejärel eraldatud tekkinud kompleks. Siiani pole olnud võimalik uurida neid vastastikmõjusid elusas organismis ega ka nende muutusi organismis vastavalt välismõjutustele.

Meie poolt väljatöötatud PAIR (PNA assisted identification of ribonucleotide binding proteins ehk PNA vahendatud nukleiinhapetega interakteeruvate valkude identifitseerimine) tehnoloogia ongi uudne selle poolest, et võimaldab tuvastada, millised valgud interakteeruvad huviorbiidis oleva nukleiinhappe järjestusega elusorganismi (raku) sees, elutegevuse käigus.

Ütleme, et meid huvitavad luu kasvu mõjutavad tegurid ja see, kuidas täpselt reguleeritakse ühe keskse ank geeni, õigemini sellele vastava RNA avaldumist. Selleks disainime RNA kunstlikud analoogid, peptiidsed nukleiinhapped ehk PNA-d, mis seonduvad spetsiifiliselt ank RNA erinevate piirkondadega. Nende kunstlike analoogide küljes on ka valgustundlik struktuur, mis UV-valguse mõjul laguneb ja moodustab keemiliselt väga reaktiivse ühendi. Selliste PNA molekulide viimisel organismi seovad nad ennast kõigepealt sihtmärk RNA külge. Kui nüüd rakke kiiritada UV-ga, muutub PNA väga reaktiivseks ning reageerib lähimate valkudega. Piltlikult öeldes – UV-ga kiiritamise ajahetkel RNA ja valgu liitühend tarretub ega saa pärastpoole enam muutuda.

Tekkinud stabiilseid valk-PNA komplekse saab muust materjalist efektiivselt eraldada. Selleks tuleb kõigepealt ära lõhkuda rakud, nii et nende sisestruktuurid ei segaks juurdepääsu meid huvitavatele komponentidele. Seejärel tuleb tükeldada RNA. Et PNA sondid on disainitud nii, et nad interakteeruvad ainult kindlate RNA-de kindlaksmääratud kohtadega, siis nüüd, kus neid kohti ümbritsevad valgud on juba kinni püütud, pole RNA-d enam vaja. Küll on aga vaja, et PNA saaks interakteeruda uute nukleiinhapetega. Täpsemalt öeldes peab valk-PNA kompleks seostuma mikromagnetite pinnale seotud DNA järjestustega. Et ensüümid, mis lõhuvad RNA-d, ei mõjuta DNA-d ja PNA-d, on lihtne saavutada olukord, kus RNA lõhutakse ning temaga seotud PNA seob ennast sobiva DNA-ga. Magnetkerakeste külge seotud valk-PNA-DNA komplekse saab magnetväljas hõlpsasti muudest lahuse komponentidest eraldada.

Lõpetuseks tuleb mikromagnetite küljes olevad valgud veel identifitseerida. Valkude identifitseerimiseks on juba aastaid olemas mass-spektromeetrilised võimalused. Segu korral eraldatakse valgud üksteisest tänu erinevale liikumisele elektriväljas (elektroforees) ja üksikud valgud lõigatakse ensüümide abil juppideks. Tekkinud lõikude segu on valgu unikaalne n-ö sõrmejälg, mis on omane vaid ühele kindlale valgule. Nii saamegi teada, millised valgud olid UV-ga kiiritamise hetkel reguleerimas meid huvitavat RNA-d.

Töödeldes organismi enne kiiritamist erinevate ainetega – tekitades stressi, lisades toiteaineid või spetsiifilisi kasvufaktoreid – saame jälgida, kuidas üks või teine tegur mõjutab “abistaja”-valkude kooslust RNA ümber.

Oma eksperimentides nägime, et mõned valgud, nagu nukleoliin, on uuritava ank RNA-ga seotud praktiliselt alati, igas situatsioonis ja erinevate RNA regioonidega. See ei ole ka üllatav, sest tegu on väga laialt levinud nukleiinhapetega seostuva valguga. Teiste valkudega oli aga pilt märksa kirjum. Näiteks teatava kasvufaktoriga (brain-derived neurothropic factor ehk ajust eraldatud neurotroofne factor) töötlemise järel jäid õnge otsa valgud, mis tavatingimustes polnud nähtavad ning mis varasemate tööde alusel on seotud valgu sünteesiga. See tähendab, et pärast kasvufaktoriga töötlemist toodeti ank RNA alusel ilmselt rohkem vastavaid ank valke. Teisest küljest selgus, et ühe teise stimulaatori, 3,5-dihüdroksüfonüülglütsiini juuresolek ja ebatavaliselt kõrge kaaliumiioonide kontsentratsioon keskkonnas pigem vähendavad valkude hulka RNA ümber. Allesjäänud valkude funktsioon pole kahjuks veel päris selge, kuid mida rohkem koguneb nende kohta infot, seda selgemaks see saab.

Kui nüüd ikka jääb selgusetuks, milleks säärane tegevus kasulik on, siis vastus on lihtne. Nagu vihjatud, määravad inimese või mis tahes elusolendi hetkeseisundi kehasisesed protsessid, mille tähtsaimad regulaatorid on valgud. Kahjuks on suhteliselt vähe teada, millised valgud ja kuidas kõigisse nendesse protsessidesse on kaasatud. Enamik seniseid uuringuid on tehtud mudelsüsteemides, mis tõstatab küsimuse, kas nad ikka peegeldavad korrektselt tegelikke elussüsteeme. Väljatöötatud PAIR metoodika võimaldab suhteliselt kiiresti identifitseerida, millised valgud ja kuidas reguleerivad RNA-sid ja seega ka nendelt RNA-delt kodeeritud valkude taset elussüsteemis. Kuigi praegused tulemused pole veel piisavad, kasvab andmete kogunemisel märgatavalt meie teadmine selle kohta, kuidas meie organismi elutalitlus on kontrollitud. Niisugune teadmine on hädavajalik efektiivsemate ja spetsiifilisemate ravimite loomiseks.


Küsitlenud INDREK ROHTMETS


LOE VEEL

Zielinski, J., Kilk, K., Peritz, T., Kannanayakal, T., Miyashiro, K.Y., Eiriksdóttir, E., Jochems, J., Langel, Ü., Eberwine, J. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 2006 Jan 31; 103(5):1557-62

Zeng, F., Peritz, T., Kannanayakal, T., Kilk, K., Eiríksdóttir, E., Langel, Ü. and Eberwine, J. A protocol for PAIR: PNA-assisted identification of RNA binding proteins in living cells. Nature Protocols 2006; 1(3).

Peritz, T., Zeng, F., Kannanayakal, T., Kilk, K., Eiríksdóttir, E., Langel, Ü., Eberwine, J. Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes. Nature Protocols 2006; 1(2), 577-580